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      2022-11-024999 次瀏覽
      細(xì)胞侵襲和遷移

      實驗準(zhǔn)備: 細(xì)胞,24孔板,細(xì)胞小室(8μm,24孔板專用),ECM Gel,10%FBS+培養(yǎng)基,無血清培養(yǎng)基,10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套槍頭,1.5 mL EP管,冰盒  


      實驗設(shè)計:

      實驗分組一般分為

      陰性組(上下層均沒有趨化因素),

      實驗組(按照實驗需要,上層或者下層加入趨化因素),

      對照組(趨化因素與實驗組中的相反)。如果有特別需要,可以再加上

      陽性組(上下層都有趨化因素)。 


      實驗操作(請細(xì)讀注意事項): 

      一、細(xì)胞侵襲實驗 

      1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解凍,實驗前轉(zhuǎn)移到冰盒中。 

      2.將1.5 mL EP、槍頭盒、細(xì)胞小室放在24孔板里面后,置于冰上預(yù)冷。 

      3.根據(jù)自己的使用量,按照ECM Gel : 無血清培養(yǎng)基=1 : 7.5在冰上稀釋成使用液。

      4.把槍頭剪去一小段(約3 μm)后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel使用液輕輕加入小室上室中,加入時慢慢移動槍頭,保證液體平鋪在底部。 

      5.放在37 ℃孵箱15 min,讓膠凝固。 

      6.消化、離心、計數(shù)細(xì)胞后,按照2.5x10^4 / mL用無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液(如果細(xì)胞很多,這一步可以提前,在4、5之前做)。 

      7.按照每孔200 μL,將細(xì)胞懸液加入小室上室,同時在小室下室加入10%FBS+培養(yǎng)基500 μL,放入37 ℃孵箱培養(yǎng)。

      8.若干小時后取出,吸去小室上室多余液體,用PBS清洗兩次,用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動,吸干水分并擦去膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞。 

      9.在上室中加入結(jié)晶紫染液,染色5 min,回收染液,用流水緩緩沖去染液,再次用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動,吸干水分。 10.在正置顯微鏡上放置一塊載玻片,將細(xì)胞小室的小孔倒置放在上面,拍照。

      11.在100倍視野下,對膜的上下左右及中間計數(shù),做平均數(shù)。

       

      二、細(xì)胞遷移實驗

      細(xì)胞遷移實驗不需要ECM Gel包被,其余步驟一致。


      實驗原理:多孔膜是聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane),膜帶有微孔,孔徑大小有0.1-12.0 μm。將細(xì)胞小室放入對應(yīng)的培養(yǎng)板中,小室內(nèi)稱上室,培養(yǎng)板內(nèi)稱下室,上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液,下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液,上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。將細(xì)胞種在上室內(nèi),由于聚碳酸酯膜有通透性,下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞,從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細(xì)胞生長、運動等的影響。


      細(xì)胞遷移和侵襲實驗常用8.0μm膜,上室種腫瘤細(xì)胞,下室加入FBS或某些特定的趨化因子,腫瘤細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室運動,從而從多孔膜一側(cè)穿過,貼壁于多孔膜的另一側(cè),計數(shù)其細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移或者侵襲能力(圓形透明小孔為微孔)。(注:遷移和侵襲是兩個概念,遷移是指細(xì)胞的運動能力,而侵襲是細(xì)胞在運動的同時會分泌出消化ECM的蛋白,清除運動障礙,這個實驗更能模擬人體內(nèi)環(huán)境) 


      注意事項 

      1.ECM Gel(貨號:E1270)由Sigma公司生產(chǎn),來源于大鼠肉瘤的細(xì)胞外基質(zhì)提取物,保存在-20℃,由于在室溫中會快速凝固,不可逆,因此需要在冰上溶解和操作,同時一切要與ECM Gel接觸的耗材也需要預(yù)冷,避免倆者接觸時溫差較大引起ECM Gel凝固粘附,造成浪費。 

      2.制作ECM Gel使用液時,先加入培養(yǎng)基,再加入ECM Gel;同時在使用量的基礎(chǔ)上多配置5-20 uL(使用量多就多配點),避免液體掛壁造成最后一次加樣不夠。 

      3.加膠時,膠的量以剛好把膠浸濕為最好(24孔的millicell需要35-40uL),過厚細(xì)胞侵襲變慢,過少則失去侵襲實驗的意義;完成后可輕輕地,均勻地拍打培養(yǎng)板四個側(cè)面,讓液體完全平鋪,這樣可以避免因為膠的厚薄不均而引起的誤差。 

      4.凝固時間可以適當(dāng)延長,但最好不要超過30min,防止液體揮發(fā)使gel凝固得過硬。

      5.通常先根據(jù)細(xì)胞的侵襲能力估計每孔小室加入的細(xì)胞數(shù)量,侵襲能力強的細(xì)胞(如231,CAF)每孔加入5,000個,那最后的細(xì)胞懸液應(yīng)該制備成2.5x104/mL,而侵襲能力弱的細(xì)胞(如MCF-7)可以提高細(xì)胞數(shù)量,達(dá)到10,000個,那最后的細(xì)胞懸液應(yīng)該制備成5x104/mL。上層加入細(xì)胞懸液后可輕輕地,均勻地拍打培養(yǎng)板四個側(cè)面,讓液體完全平鋪,避免細(xì)胞分布不均而引起細(xì)胞計數(shù)時中間多兩邊少。 

      6.加入下室中的10%FBS是作為趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞運動,24孔板下室一般加入500μl含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基,不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求,具體請參考說明書。這里要特別注意的是,下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生,一旦產(chǎn)生氣泡,氣泡處的趨化作用就減弱甚至消失了,在種板的時候要特別留心,小室在放入時傾斜緩慢放入(注意小室中的液體不要流出),可以避免氣泡。培養(yǎng)時間需要自己根據(jù)文獻(xiàn)做預(yù)實驗,尋找合適的時間點;時間點的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外,細(xì)胞數(shù)及處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視,穿過的細(xì)胞數(shù)在100-200之間最好。棉簽清洗時一定要輕柔,防止戳破多孔膜。 

      7.結(jié)晶紫是細(xì)胞核染液,細(xì)胞大小不同,染色時間也有改變,染液放置的時間和濃度也會對染色時間有影響,需要自己掌握;最優(yōu)的染色狀態(tài)是細(xì)胞核顏色深,胞漿色淺。

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